Tipificación molecular de Brucella y aplicación de la PCR al diagnóstico de la brucellosis

Brucella es el agente causante de la brucelosis, una de las cinco zoonosis bacterianas más frecuente del planeta. El objetivo general del presente trabajo ha sido el desarrollar y evaluar técnicas moleculares basadas en la reacción de PCR para la detección y tipificación de la bacteria Brucella al nivel de especie, biovariedad y cepa. Se han empleado técnicas de PCR convencional, PCR múltiple, PCR a tiempo real, PCR-RFLP y MLVA (detección de los polimorfismos en las secuencias repetidas en tandem mediante PCR).

Tras estudiar y analizar las secuencias genómicas de varias cepas de Brucella, se han seleccionado secuencias conservadas que permitan la detección del género Brucella. Además, se han analizado los polimorfismos entre las especies y biovariedades de Brucella y se han seleccionado un panel de marcadores moleculares basados en inserciones, deleciones, mutaciones puntuales y secuencias repetidas en tandem para la discriminación de Brucella.

Se ha desarrollado así una técnica de PCR múltiple (Bruce-ladder) capaz de discriminar en un solo ensayo entre todas las especies de Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis y B. neotomae), incluidas los aislamientos de mamíferos marinos, y las cepas vacunales B. abortus RB51, B19 y B. melitensis Rev1.

De forma similar, mediante otros ensayo de PCR múltiple hemos sido capaces de discriminar entre las cinco biovariedades de B. suis. Se ha desarrollado también un ensayo de PCR a tiempo real basado en sondas TaqMan MGB que permite la detección específica de todas las especies y biovariedades del género Brucella con una sensibilidad de 100 fg de DNA y una especificidad del 100%. Un ensayo similar pero de PCR a tiempo real múltiple permite la diferenciación específica en una sola reacción de B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. ovis. Mediante el análisis por MLVA se ha demostrado la estabilidad genética de la cepa vacunal Rev1, independientemente del origen geográfico, comercial o tipo de aislamiento.

Los resultados de los análisis moleculares de aislamientos de B. suis demuestran una perfecta correlación entre MLVA y otras técnicas moleculares. Sin embargo, solamente MLVA es capaz de demostrar la existencia de brotes epidemiológicos y confirmar la infección cruzada de B. suis entre animales salvajes y domésticos.

Este trabajo ha dado lugar a cinco publicaciones, una patente internacional y cuatro productos comerciales. Además, la técnica de PCR Bruce-ladder es recomendada en el “Manual de brucelosis bovina” de la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal).